Biological Psychiatry：抗抑郁的潜在新靶点——海马SIK2蛋白

盐诱导激酶（SIK1/2/3）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属AMPK家族，其在大脑神经元内的重要功能是磷酸化CREB转录调节共激活因子（CRTC1/2/3），使其无法转运入核，影响CRTC-CREB复合物的形成，从而抑制CREB的促基因转录功能。

南通大学药学院江波副教授课题组发现海马神经元内SIK2通过负性调控CRTC1-CREB-BDNF通路而介导抑郁症的发病机理；阻断海马SIK2功能产生显著抗抑郁效应；且海马SIK2参与临床抗抑郁药物氟西汀、文拉法辛以及米氮平的药理作用（图1）。

图1. 海马SIK2介导参与慢性应激诱发抑郁症过程的分子机制




这一重要成果以“Hippocampal Salt-Inducible Kinase 2 Plays a Role in Depression via the CREB-Regulated Transcription Coactivator 1-cAMP Response Element Binding-Brain-Derived Neurotrophic Factor Pathway”为题发表于Biol Psychiatry（April 15, 2019; 85:650–666；神经精神科学TOP期刊，2018年IF = 11.984）。
















研究思路与方法




课题组首先发现，慢性社会挫败应激（CSDS）与慢性不可预测温和应激（CUMS）这两种经典抑郁模型在诱发C57BL/6I小鼠抑郁样行为的同时，皆显著增加了海马神经元内SIK2的蛋白与mRNA表达水平，而不影响海马SIK1与SIK3的蛋白与mRNA表达水平（图2，图3）。

图2. CSDS应激对中枢SIK1/2/3的影响




随后，发现CSDS与CUMS都显著减少了海马神经元的核内CRTC1蛋白水平，同时显著上升其胞浆pCRTC1（Ser-151）水平，而不影响胞核CRTC2、CRTC3以及胞浆pCRTC2（Ser-171）与pCRTC3（Ser-163）的水平。qRT-PCR与Co-IP实验又相继发现CSDS与CUMS皆大幅减少海马内的CRTC1-mRNA水平以及核内CRTC1-CREB结合水平。这初步表明海马SIK2-CRTC1通路参与慢性应激诱发抑郁症之过程。

图3.  过表达海马SIK2促进诱发抑郁症




第二步，课题组通过AAV-SIK2-EGFP（SIK2过表达腺相关病毒，AAV8型；吉凯基因构建）实现了对正常C57BL/6I小鼠的海马SIK2水平过表达，随后的行为学测试发现其呈现出明显的快感缺乏、绝望无助、社交恐惧等抑郁样表现，而不影响自主活动性；之后的分子生物学检测表明此等行为伴随明显的海马核内CRTC1水平下降、胞浆pCRTC1水平上升以及核内CRTC1-CREB结合水平减少（图4）。

图4. 沉默干扰海马SIK2导致抗抑郁效应产生




并且，Western blotting与Immunofluorescence实验相继证实AAV-SIK2-EGFP过表达海马SIK2明显减少海马BDNF信号通路各分子水平（BDNF、pTrkB、pERK1/2、pAKT、pCaMKIV及pCREB）以及神经元增殖分化（Neurogenesis）水平。这直接证明海马SIK2上升是抑郁症发生的重要诱因。




如何使用AAV注射小鼠海马

使用前先将病毒用enhanced infection solution（吉凯提供）稀释至5×1012genome copies/ml。使用5μL 微注射器将AAV双侧注射到小鼠海马区，1μL/侧，注射速率0.2 μL/min，注射后针头原位停留4 min以免回流。2周后检测。




第三步，课题组使用AAV-SIK2-shRNA-EGFP（SIK2沉默干扰腺相关病毒，AAV8型；吉凯基因构建）来阻止CSDS与CUMS模型诱发的海马SIK2水平上升。相关行为学测试表明，SIK2-shRNA沉默海马SIK2显著逆转了CSDS与CUMS应激导致的小鼠快感缺乏、绝望无助、社交恐惧等抑郁样行为；相关分子生物学实验证实，SIK2-shRNA沉默海马SIK2显著逆转CSDS与CUMS引起的海马核内CRTC1水平减少、胞浆pCRTC1水平增加、核内CRTC1-CREB结合水平减少、BDNF信号通路各分子水平减少以及Neurogenesis水平降低。

进一步使用SIK2-KO基因敲除鼠，发现与正常C57BL/6I小鼠相比，CSDS与CUMS应激的给予皆无法使SIK2-KO鼠产生抑郁样症状；同时，CSDS与CUMS也无法引起SIK2-KO鼠海马核内CRTC1、胞浆pCRTC1、核内CRTC1-CREB结合、BDNF信号通路各分子水平以及Neurogenesis水平的相关变化。这直接证实以海马SIK2为干扰靶点可发挥抗抑郁效应。

第四步，区别使用AAV-CRTC1-shRNA、AAV-CREB-shRNA、AAV-BDNF-shRNA及AAV-TrkB-shRNA（CRTC1、CREB、BDNF和TrkB干扰腺相关病毒来自吉凯基因）来沉默小鼠的海马CRTC1、CREB、BDNF及TrkB表达。

结合AAV-SIK2-shRNA研究，课题组发现，当海马神经元内CRTC1、CREB、BDNF与TrkB的功能缺失时，即便阻断SIK2也将无法逆转CSDS与CUMS，产生抗抑郁效应。这表明海马SIK2正是通过其下游CRTC1-CREB-BDNF通路来影响抑郁症。

第五步，发现氟西汀、文拉法辛与米氮平这些经典抗抑郁药都显著逆转CSDS与CUMS导致的海马SIK2蛋白与mRNA水平增加、CRTC1-mRNA水平减少、核内CRTC1水平减少、胞浆pCRTC1水平增加以及核内CRTC1-CREB结合水平减少。使用CRTC1-shRNA沉默海马CRTC1则使得氟西汀等药物再无法逆转CSDS与CUMS，产生抗抑郁效应。这进一步说明海马SIK2可作为抗抑郁靶点。




研究结论




海马SIK2-CRTC1信号通路参与抑郁症过程，且证明了海马SIK2是一个十分有效的新型抗抑郁靶点，开发选择性SIK2抑制剂可成为未来抗抑郁药物研发新策略，具有显著临床价值与意义。同时拓展了对抑郁症病理机制的研究认识，首次阐明了慢性应激影响海马BDNF的内在分子机理，是“神经营养假说”的深化与补充。




作者简介

南通大学药学院药理系江波副教授为本文第一兼通讯作者，王浩与王金亮为本文共同第一作者。

江波，男，33岁，现工作于南通大学药学院，副教授，硕士生导师，世界神经科学学会会员，中国药理学会会员，江苏省药理学会会员，华中科技大学基础医学院药理系博士，美国University of Iowa博士后。长期致力于抑郁症神经生物学机制的相关研究，对查找新型抗抑郁靶点及筛选新型抗抑郁药物有着浓厚的兴趣。截止2019年，已发表相关SCI研究论文30余篇，其中第一作者/通讯作者16篇，包括Biol Psychiatry、Br J Pharmacol、Int J Neuropsychopharmacol、J Psychopharmacol、Neuropharmacology、CNS Neurosci Ther以及Psychopharmacology等。另申请发明专利1项，并获市厅级学术成果奖励2项。

王浩，男，26岁，南通大学药学院2015级硕士研究生，现为中国药科大学药学院在读博士，硕士生期间研究方向为查找新型抗抑郁靶点及筛选新型抗抑郁药物，并以第一或共同第一作者发表SCI文章3篇。

王金亮，女，25岁，南通大学药学院2017级在读硕士研究生，研究方向为查找新型抗抑郁靶点及筛选新型抗抑郁药物，并以第一或共同第一作者发表SCI文章2篇。

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